免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結出許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質選擇適當?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。

由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個免疫熒光實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反復優(yōu)化外，還必須設立嚴謹?shù)膶嶒瀸φ铡？傊庖邿晒鈱嶒瀼募毎麡悠诽幚怼⒐潭ā⒎忾]、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。